Penanaman Tunas (kultur jaringan)

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan salah satu tekhnik memperbanyak suatu tanaman dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam keadaan steril. Teknik kultur jaringan bukan hanya digunakan untuk beberapa tujuan seperti mendapatkan produksi metabolit sekunder, mendapatkan keragaman seleksi dan pemuliaan tanaman.

Langkah pertama yang harus dilakukan apabila akan melakukan kultur jaringan adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai, karena akan menyangkut materi yang akan digunakan. Misalnya tujuannya ingin memperbanyak tanaman dengan hasil yang sesuai dengan induknya, maka dilakukan kultur meristem atau kultur kalur. Apabila tujuannya ingin mendapatkan tanaman yang homozigot, dilakukan kultur anther. Langkah berikutnya adalah menentukan medium yang akan digunakan dengan menambahkan ZPT vitamin dan suplemen lainnya. Selanjutnya adalah tahap kerja di laboratorium.

Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses terakhir yaitu penanaman eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga masih digunakan pada pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada pross penanaman eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh karenanya penanaman biasanya dilakukan di Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang transparan dan terdapat lubang untuk tangan, atau dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow).

Penanaman eksplan harus dilakukan pada ruangan yang harus steril, dan eksplan juga dalam keadaan yang steril pula.  Penanaman dapat dilakukan pada ruangan tertutup atau ruangan penabur  dalam Laminair Air Flow (LAF). Ruangan digunakan, setelah dilakukan sterilisasi dengan menggunakan larutan alkohol 96 % pada lantai dan dinding ruangan, dan membiarkan ruangan selama 30 menit dengan sinar UV yang menyala.

Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media kultur, tanaman atau eksplan yang akan ditanam juga harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak terserang penyakit ataupun terkena serangan mikroba.

Keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk itu sterilisasi ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk menciptakan lingkungan yang aseptic dan menghilangkan mikroba maupun spora penyebab kontaminan.

1.2  Tujuan

1.      Mengetahui dan mempraktikan cara menanam eksplan dan sub kultur.

2.      Mengamati pertumbuhan eksplan.

3.      Mencari factor-faktor penyebab kontaminasi dalam kultur  jaringan.

BAB 2

 TINJAUAN PUSTAKA

Dengan semakin berkembangnya usaha di bidang pertanian maka kebutuhan bibit semakin meningkat. Melalui perbanyakan konvensional sangat sulit untuk memenuhi kebutuhan bibit yang sangat banyak dengan waktu relatif cepat. Dengan demikian, teknologi kultur jaringan telah terbukti dapat digunakan sebagai teknologi pilihan.( Mariska, 2008 ).

Menurut Sriyanti (1994), kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Tujuan dari  Kultur jaringan diantaranya menciptakan tanaman baru bebas penyakit, memperbanyak tanaman yang sukar diperbanyak secara seksual, dan menghasilkan tanaman baru sepanjang tahun (Hendaryono,1994).

Kultur jaringan atau biakan jaringan merupakan teknik pemeliharaan jaringan atau bagian dari individu secara buatan (artifisial). Yang dimaksud secara buatan adalah dilakukan di luar individu yang bersangkutan. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in vitro (bahasa Latin, berarti "di dalam kaca") karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan secara teoretis dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan maupun hewan (termasuk manusia) namun masing-masing jaringan memerlukan komposisi media tertentu (Hendra, 2007).

Pertumbuhan dan perkembangan dalam kultur in vitro dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya: faktor genetik, media tumbuh, faktor lingkungan, dan zat pengatur tumbuh. Menurut Wetherell (1982), zat pengatur tumbuh (ZPT) di dalam dalam media berfungsi untuk mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman pada setiap tingkat pertumbuhan dan perkembangan.

Di dalam tanaman terdapat fitohormon yang mendorong pertumbuhan dan perkembangan, serta fitohormon yang menghambat. ZPT akan bekerja secara aditif (sinergis) dengan fitohormon (pendorong) atau antagonis dengan fitohormon yang menghambat. Resultan dari interaksi ini akan tampil dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Menurut Gardner (1991) tanaman pada kultur jaringan tidak dapat menghasilkan karbohidrat sendiri dalam jumlah cukup sehingga perlu diberikan sumber energi karbon dalam media berupa sukrosa.

Proses perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan terdiri atas seleksi pohon induk (sumber eksplan), sterilisasi eksplan, inisiasi tunas, multiplikasi, perakaran, dan aklimatisasi. Eksplan berupa mata tunas, diambil dari pohon induk yang fisiknya sehat. Tunas tersebut selanjutnya disterilkan dengan alkohol 70%, HgCl2 0,2%, dan Clorox 30%. Inisiasi tunas. Eksplan yang telah disterilkan di-kulturkan dalam media kultur (MS + BAP). Setelah terbentuk tunas, tunas tersebut disubkultur dalam media multiplikasi (MS + BAP) dan beberapa komponen organik lainnya. Multiplikasi dilakukan secara berulang sampai diperoleh jumlah tanaman yang dikehendaki, sesuai dengan kapasitas laborato-rium. Setiap siklus multiplikasi berlangsung selama 2–3 bulan. Untuk biakan (tunas) yang telah responsif stater cultur, dalam periode tersebut dari 1 tunas dapat dihasilkan 10-20 tunas baru. Setelah tunas mencapai jumlah yang diinginkan, biakan dipindahkan (dikulturkan) pada media perakaran ( Biogen, 2008 ).

Untuk perakaran digunakan media MS + NAA. Proses perakaran pada umumnya berlangsung selama 1 bulan. Planlet (tunas yang telah berakar) diaklimatisasikan sampai bibit cukup kuat untuk ditanam di lapang. Aklimatisasi. Dapat dilakukan di rumah kaca, rumah kasa atau pesemaian, yang kondisinya (terutama kelembaban) dapat dikendalikan. Planlet dapat ditanam dalam dua cara. Pertama, planlet ditanam dalam polibag diameter 10 cm yang berisi media (tanah + pupuk kandang) yang telah disterilkan. Planlet (dalam polibag) dipelihara di rumah kaca atau rumah kasa. Kedua, bibit ditaruh di atas bedengan yang dinaungi dengan plastik. Lebar pesemaian 1-1,2 m, panjangnya tergantung keadaan tempat. Dua sampai tiga minggu sebelum tanam, bedengan dipupuk dengan pupuk kandang (4 kg/m2) dan disterilkan dengan formalin 4%. Planlet ditanam dengan jarak 20 cm x 20 cm. Aklimatisasi berlangsung selama 2-3 bulan. Aklimatisasi cara pertama dapat dilakukan bila lokasi pertanaman letaknya jauh dari pesemaian dan cara kedua dilakukan bila pesemaian berada di sekitar areal pertanaman ( Biogen, 2008 ).

BAB 3

METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Hari/tanggal          : Selasa, 19 November 2013

       Waktu                  : 11.00 WIB – 13.00 WIB

Tempat                 : Laboratorium  

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat ·         4 Gelas Media ·         3 Tutup Gelas ·         Label ·         Bulpoin ·         masker ·         1 Karet Gelang ·         1 Alumunium Foil ·         Pinset ·         pisau

·         petrudis ·         tisyu ·         kertas ·         bunsen 3.2.2 Bahan ·         Tanaman ·         Alkohol ·         Media

3.3  Prosedur Kerja

  Adapun prosedur kerja praktikum pengenalan alat ini yaitu:

a)       Persiapan ruang penabur

1. Sebelum digunakan ruang penabur disterilkan dengan sinar UV selama 30 menit atau dengan menyemprotkan alcohol 96% ke bagian tangan dan botol yang berisi media

2. Alat-alat yang digunakan diatur dengan rapi pada LAF, posisi scalpel dan pinset serta alcohol 96% yang digunakan untuk mensterilkan dissecting kit (scalpel dan pinset) disebelah kiri Bunsen sedangkan botol kultur disebelah kanan.

3. Petridish diletakan dibagian tengah, setiap selesai eksplant dipotong petridish ditutup kembali untuk menghindari kontaminasi.

4. Selesai digunakan alat disterilkan dengan alkohok dan dibakar dengan Bunsen.

5. Sebelum masuk kedalam LAF semua seperti botol dan tangan harus disterilkan dengan alcohol 96%.

6. Setiap selesai menggunakan pinset maupun scalpel, lalu dicelupkan kedalam alkohol, lalu dibakar pada nyala api bunsen.

b)       Penyiapan Eksplan

Eksplan adalah bahan tanaman yang akan dikulturkan, dapat berupa daun, tunas, pucuk, bunga, endosperm, buah muda, sel, protoplas dan yang lainnya.

c)       Penanaman Eksplan

1.       Disiapkan alat-alat yang akan digunakan untuk penanaman eksplan.

2.       Diambil potongan eksplan yang sudah siap untuk ditanam dengan pinset.

3.       Dibuka botol kultur yang telah berisi media dan dibakar bagian mulut botol.

4.       Diletakan eksplan kedalam media dengan hati-hati.

5.       Botol ditutup dengan kertas aluminium foil dan diseal.

6.       Diletakan pada ruang inkubasi.

7.      Diamati perkembangan eksplan.

BAB 4

 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Dari praktikum pembuatan media di peroleh  hasil sebagai berikut:

a.       Diperoleh larutan stock yang telat ditanami tunas murbey 4 glas

b.      Semua botol yang diproleh setelah disimpan selama dua sampai tiga hari setelah penyimpanan media tidak ada jamur atau bakteri yang tumbuh.

c.       Prosentase kesuksesan 100%

Hari / Tanggal Pengamatan	No Botol Eksplan			Keterangan
		123,4			123,4
Kamis, 21 November 2013	Belum Tumbuh	Belum Tumbuh	Belum Tumbuh	Eksplan, media (baik)	Eksplan, media (baik)	Eksplan, media (baik)
Kamis, 22 November 2013	Belum Tumbuh	Belum Tumbuh	Belum Tumbuh	Eksplan, media (baik)	Eksplan, media (baik)	Eksplan, media (baik)
Kamis, 24 November 2013	Belum Tumbuh	Belum Tumbuh	Belum Tumbuh	Eksplan, media (baik)	Eksplan, media (baik)	Eksplan, media (baik)

4.2  Pembahasan

   Kmenanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam keadaan steril. Dalam melakukan proses kultur jaringan ada beberapa langkah yang harus dilakukan diantaranya adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai hal ini penting karena menyangkut materi yang akan digunakan. Setelah mengetahui tujuan yang aingin dicapai langkah yang dilakukan berikutnya adalah menentukan medium yang akan digunakan.( Nasir,2001)

           Proses ultur jaringan merupakan salah satu teknik memperbanyak suatu tanaman dengan cara kultur jaringan tidak bisa dilakukan di temapt yang sembarangan, akan tetapi dilaksanakan pada laboratorium tertentu. Proses penyimpanan eksplan dilakukan di dalam ruang penabur. Dimana ruang penabur merupakan kunci keberhasilan budidaya in-vitro. Didalam ruangan ini semua dilakukan dengan steril, dan pengawasan kesterilan di ruang penabur tersebut  sangat ketat.( Moeso S,1996 )

         LAF cabinet merupakan suatu kotak tempat sterilisasi dan penanaman eksplan ( bahan tanam ). Di dalam laminar, terdapat blower  dan lampu ultra violet. Blower menghembuskan udara halus melalui suatu kotak filter yang fungsi  untuk mencegah kontaminan yang berasal dari udara. Sementara itu, lampu ultra violet berfungsi untuk mematikan kontaminan yang berada di permukaan dalam laminar, permukaan dalam laminar dilap dengan kapas atau tissu yang sebelumnya dicelupkan dalam alkohol 70% dan lampu ultra violetnya dinyalakan selama 0,5-1jam (Hendaryono,1994 ).

Prinsip kerja Laminar Air Flow Cabinet

a)      Lamianar Air Flow Cabinet digunakan sebagai meja kerja steril untuk kegiatan inokulasi/ penanaman.

b)      Laminar Air Flow Cabinet mengutamakan adanya hembusan udara steril yang digerakkan oleh blower yang disaring oleh HEPA Filter.

c)      Sebelum dioperasikan Laminar Air Flow Cabinet harus dinyalakan minimal 30 menit dan harus dilakukan penyemprotan dengan alcohol agar alat dan ruang kerja tersebut terjamin kesterilannya.

d)     Pada saat melaksanakan pekerjaan, harus dinyalakan blowernya yang berfungsi sebagai penghembus udara steril dan lampu TL sebagai penerang.

e)      Agar Laminar Air Flow Cabinet dapat difungsikan setiap saat, pemeliharaan dan perawatan alat harus selalu dilakukan.

Cara kerja Laminar Air Flow Cabinet

• a)      Bersihkan meja kerja dengan menggunakan tissue, Semprot meja kerja dengan menggunakan alkohol tanpa mengenai bagian filter HEPA.
• b)      Tutup kaca Laminar Air Flow Cabinet, kemudian nyalakan lampu UV selama 30 menit.
• c)      Setelah minimum 30 menit, matikan lampu UV dan buka kaca laminar air flow cabinet serta nyalakan lampu TL dan blower.
• d)     Siapkan pisau scalpel dan pinset pada meja kerja steril Semprotkan alat tersebut dengan menggunakan alcohol.
• e)      Bakarlah alat tersebut dengan menggunakan nyala api lampu spirtus. Lakukan kegiatan inokulasi dengan hati-hati dan cermat sesuai dengan petunjuk kerja.
• f)       Bersihkan kembali Laminar air flow cabinet sehingga dalam kondis siap pakai.  Matikan blower dan lampu TL, tutup kembali pintu kaca meja steril.
• Sterilisasi eksplan dapat dilakukan atau dilaksanakan dengan dua cara yaitu secara mekanik dan secara kimia.
• a.   Sterilisasi eksplan secara mekanis. Cara ini digunakan untuk eksaplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan membakar eksplan tersebut diatas lampu spirtus sebanyak tiga kali. Eksplan keras yang disterilkan dengan cara ini adalah tebu, biki salak, bung, buah anggrek, akapulaga dan sebagainya.
• b.    Sterilisasi secara kimiawi digunakan untuk eksplan yang lunak seperti daun, tangkai daun, dan sebagainya.  Bahan kimia yang sering dipakai untuk disinfestasi adalah alkohol seperti etil, metil, atau isopropyl-alkohol dengan konsentrasi 70-80%, Ca-hipoklorit atau Na- hipoklorit. 

Macam-macam bahan untuk sterilisasi dan fungsinya:

1. Deterjen (Membershkan kotora/debu dari eksplan)
2. Fungisida (Memberihkan jamur/cendawan)
3. Bakterisida (Membersihkan bakteri)
4. Alkohol 70% dan 95%

5.  Sodium hipoklorik dengan nama dagang clorox atau bayclin
6. Mercury chlorit dengan nama dagang sublima 0,05 %

7. Tween -20 (Agen pembasah)
8. Antibiotik
9. Iodine/betadine Antiseptik

           Satu hal yang penting dalam sterilisasi permukaan eksplan adalah mengkompromikan antara usaha untuk mendapatkan eksplan yang steril dan menjaga agar jaringan eksplan tidak rusak akibat tingginya konsentrasi disinfektan.  Untuk meminimalkan tingkat kontaminasi dan mendapatkan pertumbuhan eksplan yang cepat, beberapa perlakuan (threatment) terhadap tanaman induk .

         Eksplan sendiri adalah bagian tanaman yang dipakai untuk bahan budidaya atau kultur jaringan. Eksplan yang baik adalah :

a)      Bagian tanaman yang masih muda

b)      Diambil dari tanaman yang tumbuh subur dan sehat

c)      Dinding sel amsih tipis dan belum berpembuluh kayu

d)     Bersifat  merismatik atau meristemoid.

Sterilisasi sangat penting karena :

a)      Jasad renik yang terbawa eksplan akan tumbuh menutupi eksplan dan media sehingga dapat menghancurkan jaringan yang akan ditanam.

b)      Adanya jasad renik akan mengubah lingkungan karena hilangnya zat makanan di media dan dilepaskan produk metabolit tambahan ke dalam media dan dilepaskannya produk metabolit tambahan ke dalam media, sehingga dapat menghancurkan eksplan yang akan ditanam.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam kegiatan inisiasi/penanaman yakni sebagai berikut : ( Hawaauriz, 2009 ).

1.    Alat dan bahan yang dimasukkan dalam laminar harus dipastikan dalam keadaan steril sehingga perlu dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70 %.

2.    Untuk mengurangi masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan, sebelum membuka tabung kultur sebaiknya mulut tabung digarang pada api terlebih dahulu

3.    Kegiatan penanaman diusahakan dilakukan dengan cepat, karena semakin cepat dilakukan penanaman maka eksplan tidak akan terlalu lama berikatan dengan oksigen sehingga kemungkinan untuk browning semakin kecil.

           Sebagai sumber utama kontaminan, eksplan memiliki perlakuan khusus pada proses sterilisasinya. Diantranya adalah pencucian dengan menggunakan deterjen ditujukan untuk menghilangkan sisia-sisa tanah pada umbi eksplan. Selanjutnya di rendam dalah alcohol untuk menghilangkan atau membunuh kuman. Selanjutnya dicelupkan pada larutan klorok untuk membunuh mikroba terutama yang ada di bagian dalam eksplan. Digunakan pula fungisida untuk membunuh spora ataupun cendawan yang diperkirakan ada pada eksplan.

           Praktikum kultur jaringan kali ini, eksplan yang digunakan adalah murbei dan ditanam pada media yang telah dibuat sebelumnya yaitu Media MS. Setelah dilkukan penanaman, eksplan tersebut diamati selama kurang lebih 5 hari untuk mengetahui apakah terjadi kontaminasi pada eksplan atau pun media.

       Adapun kontaminasi yang sering terjadi pada kultur jaringan tanaman terdiri atas dua jenis yaitu kontamiasi oleh bakteri dan kontaminasi oleh jamur. Untuk membedakan kedua jenis kontaminasi ini, dapat dilihat dari ciri-ciri fisik yang muncul  pada eksplan maupun media kultur. Bila terkena kontaminasi bakteri maka tanaman akan basah atau menyebabkan adanya lendir, hal ini dikarenakan bakteri langsung menyerang terhadap jaringan dari tubuh tumbuhan itu sendiri. Sedangkan bila terkontaminasi oleh jamur, tanaman akan lebih kering dan akan muncul hifa jamur pada tanaman yang terserang dan biasanya dapat dicirikan dengan adanya garis – garis (seperti benang) yang berwarna putih sampai abu – abu. Penyebab terjadinya kontaminasi bisa diakibatkan karena kesalahan pada saat penanaman, saat sterilisasi media dan eksplan atau bahkan pada saat pembuatan media.

           Berdasarkan pengamatan dilakukan selama (3 kali pengamatan) ternyata) kondisi eksplan dan media tumbuh kultur masih dalam keadaan baik pada pengamatan kesatu, kedua dan ketiga

BAB 5

PENUTUP

5.1  Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan maka dapat diperoleh kesimpulan bahwa :

1. Penanaman eksplan dilakukan di LAF (Laminar Air Flow). Penggunaan alat sebelumnya sudah dalam keadaan steril. Penanaman dilakukan dengan cara mencelupkan scalpel dan pinset ke dalam alcohol 96% lalu dibakar pada nyala api Bunsen. Setelah itu alat baru bisa digunakan untuk menanam. Pada setiap botol kultur, diisi 1 potong eksplan.

2. Pada eksplan batang murbei tidak terkontaminasi oleh jamur, hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya kontaminan yang berwarna putih dan membentuk seperti benang (hifa).dll

5.2 Saran

Dalam pemotongan eksplan, sebaiknya dibentuk lebih lancip untuk bagian yang akan ditanam guna memudahkan dalam proses penanaman eksplan.

DAFTAR PUSTAKA

Ardiansyah. 2013. Laporan Pembuatan Media. [Online]. Tersedia: http://fiqhiardiansyah.blogspot.com/2013/04/pembuatan-media.html.  [15 November 2013].

Anonim. Kultur Jaringan. [Online]. Tersedia:http://hude354.wordpress.com/kultur-jaringan/. [20 November 2013].

Anonim. Laporan Studi Lapang Kultur Jaringan. [Online]. Tersedia: http://arsipjurnal.blogspot.com/2012/03/laporan-studi-lapang-kultur-jaringan.html[20 November 2013].

Siregar. 2012. Laporan Kultur Jaringan Penamnaman. [Online]. Tersedia: http://hm-siregar.blogspot.com/2012/02/laporan-kultur-jaringan-penanaman_9291.html. [20 November 2013].